TMB（3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine）是辣根过氧化物酶（HRP）的常用显色底物之一。在HRP的催化下，TMB被H2O2氧化生成蓝色产物。主要吸收峰在370nm和652nm。在加入硫酸或者磷酸终止上述反应后，产物转变为黄色，最大吸收峰为450 m。传统的TMB显色试剂通常以AB液形式提供（TMB和H2O2溶液分到两管，使用前才可混合使用），并且容易产生沉淀，使用起来相对不方便，且容易导致操作误差。为克服以上缺点，我们采用最新的TMB显色技术，将所有相关试剂混合配成单一溶液，本产品具有以下特点：

1、即开即用，操作简单，使用前无需做AB液混合的准备；检测灵敏度不低于AB液体系；

2、仅由单一溶液组成，简化了操作步骤，也降低了操作误差，结果更加稳定；

3、含有独特的稳定剂，保证溶液4℃下长期保存；

4、相比于其他HRP酶显色底物（如ABTS和OPD）相比，检测灵敏度更高，而且本TMB溶液不含有DMF或DMSO等有机溶剂，安全无毒。

本品为单一溶液形式且沉淀可溶型的TMB显色液，适用于ELISA检测，操作时只需加入200μl即用型的显色液，做简单孵育，加入ELISA终止液（BL1171A）或2M H2SO4终止反应后，即可用分光光度计在450nm处测定吸光度。本品可供完成约500个样品的检测。另外，本品也可用于血液或血红蛋白等样品中过氧化物酶量的检测。

保存条件：

4℃避光保存，有效期一年。

使用方法：

1、使用之前，取出适量TMB显色液，使其回到室温再开始使用。

2、对于ELISA检测：参考ELISA 检测试剂盒的实验步骤，当加入HRP标记的抗体并孵育一段时间后，用适当洗涤液洗涤3-5次，每次3-5min。洗涤完毕后，去除洗涤液，加入200μl TMB显色液；对于在96孔板内进行的其他适当检测（如检测组织或细胞样品内源性过氧化物水平）：直接在96孔板内加入10-20μl样品，之后加入200μl TMB显色液。

3、室温避光孵育3-30min或更长时间（可长达24h），直至显色至预期深浅（此时反应液为蓝色）。

4、加入50μl ELISA终止液（BL1171A）或2M H2SO4终止反应，溶液由蓝色转变为黄色，随后在450nm测定吸光度。或着在370nm或652nm测定吸光度。

常见问题：

一、背景显色太深

1、如果背景（没有样品的对照）显色太深，一方面需考虑使用适当的封闭液进行封闭，如商业化的封闭液或者商业化的和一抗相同来源的血清（5-10%）进行封闭。另一方面，直接使用经过适当亲和吸附的二抗，以减小二抗的非特异性交叉吸附。

2、可以考虑缩短显色时间，或降低二抗浓度。另外，选择适当强度的洗涤液，或延长洗涤时间。

3、可考虑TMB底物本身反应过于强烈。为了避免沉淀的产生，可在终止反应后马上读数，或者进一步稀释一抗和HRP结合物。

二、没有显色或显色太弱

1、适当提高一抗或二抗的浓度。检测二抗效果，滴一滴稀释二抗在离心管内，检测二抗是否被正常显色。

2、可以使用更加灵敏的放大检测体系，例如使用生物素检测体系。

3、可以适当延长显色时间。

4、如果上述改进不能获得预期效果，可以考虑更换效果更好的一抗或ELISA。

注意事项：

1、TMB对人体有刺激性，操作时请小心，并注意适当防护以避免直接接触人体或吸入体内。

2、本产品为无色至微蓝色透明溶液，如果发现TMB显色液出现混浊或颜色变成较深的蓝色，应该停止使用。

3、本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。

4、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。